國民政府於民國17年定都南京，內政部於同年4月成立，依其組織法，規定內政部設秘書處及民政司、土地司、警政司、衛生司等1處4司，掌理地方行政、選舉、國籍、戶籍、自治團體、徵兵、社會救濟、行政區劃、警政、禮制、公共工程及公共衛生等事項，同年10月國民政府組織法公布，行五院制，內政部直屬行政院。同年12月修正內政部組織法，分設總務司、統計司、民政司、土地司、警政司、禮俗司等6司，其原有之衛生司奉令裁撤，另設衛生部，迨民國20年4月，衛生部奉令裁併於內政部，因此組織法再經修正，成立衛生署。另內政部直轄警察機構有二，一為首都警察廳，一為警官高等學校。內政部成立之初在鼓樓北附近租賃民房辦公。迨民國18年4月，江蘇省政府移治鎮江，內政部遷入其原址（瞻園路124號）。民國24年12月統計司改組為統計處，直隷國民政府主計處。民國25年7月，內政部組織法又經修正，土地司改稱地政司。同年9月，依據行政院頒布「整理警政原則」，將內政部警官高等學校與浙江省警官學校合併，改設為中央警官學校，原由各省辦理之少數警官學校一律停辦，而全國警官教育均由中央警官學校統一辦理，實為我國警察教育史上一大改革。
民國26年7月，蘆溝橋事變發生，抗戰開始，內政部於同年11月中旬奉令西遷，全部人員分水陸兩路離京，至漢口集中，其時蔣部長作賓奉令調任安徽省政府主席，另任命何鍵為部長。旋於12月下旬，復由水道轉至長沙，至民國27年1月中旬全部人員離湘赴宜昌，再分批由水運抵達重慶，租定觀音岩義林醫院3樓為辦公處。禁煙委員會於民國27年2月，依照中央調整機構案之決議，改隷內政部，主管全國禁煙及國際禁煙合作事宜。民國28年5月3、4兩日，敵機大肆襲渝，在渝各機關均奉令疏散下鄉，內政部即遷移於離城45公里之巴縣虎溪鄉陳家橋傅家院子為辦公處。
原由部轄之衛生署，於民國28年7月改隷行政院，部內原有之地政司，於民國31年5月擴編為地政署，並隷屬行政院。全國人口行政原係民政司職掌之一，旋以辦理徵兵、推動自治及人口查記等各項工作亟需積極開展，乃於民國31年7月增設戶政司，辦理全國戶籍行政。經8年之抗戰，各地大小城市破壞重大，為適應政治社會經濟國防之需要及規劃城鎮之重建，爰於民國31年7月成立營建司，專掌全國建築行政。
民國33年12月，購置重慶神仙洞街98號房屋2棟為內政部駐渝辦事處，指派一部分人員常駐川渝，自是分城鄉兩處辦公，既與市區各機關取得聯繫，工作效率亦隨之倍增。
民國34年8月，抗戰勝利，內政部即奉令積極辦理還都復員，先由部次長統率重要人員來京工作，次由水陸分批陸續運送，至民國35年10月全部復員完成。
經長期之抗戰，我國人力、物力、財力之損失雖屬不可勝計，而民族精神、政治意識經此鍛鍊淬勵，靡不增強，尤以抗戰後期，政治力圖推動地方自治，充實基層組織，並決心實施憲政，此種政治革新，促成我國警政不能不急圖改進，實施法治精神，為履行警政建設5年計劃，曾於民國35年8月，將原有之警政司，擴充改組成立警政總署，充實中央警政機構，以增進全國警政之建設。
自抗戰以還，我國深恐邊疆情形之複雜，對於國界管理勘測保衛及經費籌措與人員配備等需要至為迫切，內政部乃於民國35年10月增設方域司，凡全國邊疆之測量勘查、界案糾紛之處理、各省行政區域自治區域之劃分調整勘測及區域名稱與治所之釐訂，又各區行政區域資料之蒐集、圖誌之編印、水陸地圖之審查等事項，悉以屬之。
民國35年7月修正內政部組織法有關新增業務局司的主要職掌為戶籍行政及方域行政。同年11月增設著作權審定委員會。
我國為積極實行憲政，於民國36年元旦公布憲法，同年4月完成實施憲政準備，5月復將衛生、地政兩署擴編為部，直屬行政院，另為加強各省市地方推行戶政之督策，將戶政司擴組為人口局，以適應業務推展之需要。
因共匪全面作亂，政府於民國38年4月播遷廣州，緊縮機構，方域司亦於此時裁撤。同年5月，將社會、地政及衛生3部併入內政部，社會部業務改設社會、勞工及合作3司掌理，地政及衛生兩部則改為地政署及衛生署。警政總署回復為警政司，禁煙委員會裁撤，其業務併入警政司。人口局亦回復為戶政司。方域及營建2司裁併入地政署，禮俗司併入民政司。同年8月原麻醉藥品經理處、藥品供應處、傷殘重建院改隷內政部，同年9月地政及衛生兩署再縮編為司，並將人事室擴編為人事處。